Een peptide wordt niet geoogst maar gebouwd, aminozuur voor aminozuur. Wie dat proces kent, begrijpt ook waar de onzuiverheden vandaan komen die je later in het chromatogram terugziet.
Vaste-fase synthese
De keten groeit op een vaste drager: een korrel hars waaraan het eerste aminozuur vastzit. Daarna herhaalt zich telkens dezelfde cyclus. De beschermgroep gaat eraf, het volgende aminozuur wordt gekoppeld, en alles wat niet heeft gereageerd wordt weggespoeld. Voor een peptide van dertig aminozuren doorloop je die cyclus dus dertig keer.
Het voordeel is dat je na elke stap kunt wassen zonder het product kwijt te raken; het zit immers vast aan de hars. Pas aan het einde wordt de keten losgemaakt.
Waar het misgaat
Geen enkele koppeling verloopt voor honderd procent. Slaat er ergens een aminozuur over, dan krijg je een keten die één schakel mist: een deletiepeptide. Die lijkt zo sterk op het doelmolecuul dat hij er in de HPLC vlak naast komt te liggen, wat het scheiden lastig maakt.
Daarnaast ontstaan er varianten waarbij een beschermgroep is blijven zitten, en bij langere ketens neemt de kans op afbraak tijdens de synthese toe. Hoe langer het peptide, hoe meer van dit soort verwanten je uiteindelijk moet wegvangen.
Opzuivering
Na het losmaken van de hars gaat het ruwe mengsel door preparatieve HPLC. Daar wordt op dezelfde manier gescheiden als bij de analyse, alleen nu om de hoofdfractie op te vangen in plaats van hem te meten. Dit is de stap die bepaalt of je op 95% of op 99% uitkomt, en het is ook de stap waar rendement verloren gaat: strenger scheiden betekent minder opbrengst.
Lyofilisatie
De opgevangen fractie wordt ingevroren en onder vacuüm gedroogd, waarbij het ijs rechtstreeks overgaat in damp. Wat overblijft is een luchtig wit lyofilisaat dat zonder koeling verzonden kan worden en bij 2–6 °C jarenlang stabiel blijft. Pas als jij er oplosmiddel aan toevoegt, begint de houdbaarheid opnieuw te lopen.